L'identification et la caracterisation du site dif des Bacil
Les cellules avec un chromosome circulaire et systeme de recombinaison homologue doivent être en mesure de transformer les chromosomes circulaires en dimeres ou encore en multimeres. Ces dimeres sont issus d'un nombre impair de recombinaisons survenues entre les chromosomes sœurs durant la replication. Si la transformation du dimere en monomere n'a pas lieu cela va empêcher la bonne division du materiel genetique en nouvelles cellules filles. En analysant de nombreuses donnees, donnees in vivo et in vitro, il a ete possible de dresser un modele sur la coordination de la resolution des dimeres et sur les divisions cellulaires chez E. coli.Chez E. coli, deux tyrosines recombinases ayant chacune un site specifique, soit XerC et XerD, agissent ensemble sur le site dif, site situe pres de la terminaison du chromosome de replication, pour transformer les chromosomes dimeres en monomeres durant la division cellulaire. La deletion du site dif chez la bacterie E.coli ou encore une mutation de XerD entraînent le developpement d'une sous-population de cellules filamenteuses qui contiennent des nucleotides divises de facon anormale. En outre, il a ete demontre que la proteine FtsK doit être localisee a l'etranglement de la
La sporulation est diminue chez les mutants impliques dans la formation des dimeres La fonction catalytique d'une tyrosine recombinase monomere est de cliver et de proceder a l'echange d'un brin d'ADN entre deux synapses aux sites de recombinaison. En nous basant sur la similarite des sequences entre le site Bsdif et les sites d'E. coli et H. influenzae, des « substrats suicides » ont ete construits en faisant des entailles dans le milieu de la region centrale sur le brin superieur et inferieur. Le brin superieur est d'ailleurs le premier brin a être echange lors d'une recombinaison a site specifique par XerC au site psi. Il y a eu transformation d'environ 70% du substrat en un complexe covalent apres une incubation de CodV et de RipX avec le brin superieur. En outre, ce complexe est mobile ce qui prouve donc que CodV-MBP est responsable du clivage du brin superieur de Bsdif. D'apres les resultats, la bande migre plus rapidement que le substrat ce qui prouve donc qu'il y un faible niveau de clivage du brin inferieur pendant la reaction. Ces resultats sont generes avec le substrat brin superieur Bsdif et non avec le substrat brin superieur Ecdif. La difference entre les quantites de brins clives produites par CodV-MBP en presence ou absence de RipX illustre l'importance des interactions entre les recombinases alliees pour le contrôle de l'activite catalytique dans le complexe de liaison. Les experiences precedentes montrent que CodV et RipX sont capable de lier les sites dif de E.coli et qu'ils interagissent avec XerC et XerD malgre la grande difference evolutionnaire entre les deux organismes d'où ces proteines sont derivees. D'autres preuves ont montre que CodV et RipX sont des partenaires catalytiques. De plus, une synapse, c'est-a-dire une reaction a etages multiples, est formee seulement lorsque ces deux recombinases sont presentes. Le site Bsdif est delimite par deux demi-site de 11 pb qui partagent un radical divalent symetrique separes par une region centrale de 6 pb. En alignant Bsdif avec les sites dif des E. coli, d'Haemophilus influenza ainsi que de deux plasmides avec des sites de recombinaisons ont constate que la sequence demi-site de droite est hautement conservee tandis que celle de gauche l'est moins. Cette similarite de la sequence droite explique sans doute la grande affinite de liaison de la recombinase RipX au site dif de E.coli. Pour verifier si CodV et RipX pouvaient se lier scientifiquement au site Bsdif, on a utilise une analyse au gel de retardement avec de l'ADN et du MBP purifie qui s'est fusionne aux recombinases. L'addition de CodV-MBP a Bsdif donne naissance a un complexe proteine-ADN qui migre avec une mobilite compatible a celle d'un monomere de recombinaison seul qui se lie au site de recombinaison. L'incubation de RipX-MBP avec Bsdif donne naissance a un seul complexe majeur qui est compatible pour se lier avec un monomere simple. Cette recherche illustre trois faits saillants sur la division chromosomale de B. subtilis. Premierement nous avons identifie et caracterise un site dif sur les B. subtilis. Deuxiemement, nous avons montre que les proteines homologues a FtsK, soit SpoIIIE et YtpT ne sont pas requises pour la recombinaison sur Bsdif. Troisiemement, nous avons note une augmentation des erreurs de la division du chromosome s'il y a absence de VopP, produit du phage SPb. Cette absence de Yop ou du phage SPb cause davantage de dommages chez les mutants CodV. Trois preuves experimentales on prouver l'existence du site dif chez les B.subtilis. Premierement l'integration non-autonome des plasmides de replication porteurs, soit du clone d'ADN Bsdif ou un oligomere de Bsdif se produisait a haute frequence dans les origines RecA. L'integration des plasmides porteurs de Bsdif depend de la presence de RipX, CodV et du site chromosomal dif. Deuxiemement, l'enlevement du site dif du chromosome cause une difformite nucleotidique chez une sous-population de cellules. De plus, ces cellules di
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